研究人员首次解决了LRRK2是帕金森氏症和自身免疫性疾病的主要危险因素。加州大学圣地亚哥分校(University of California, San Diego)的结构生物学家利用创新的方法提供了对这种分子的两种互补观点。Elizabeth Villa领导的研究人员在8月7日的《细胞》杂志上描述了细胞内全长致病LRRK2的三维结构。这种蛋白质在微管周围形成丝状结构。Andres Leschziner领导的研究人员分离出了适合冷冻电镜的野生型LRRK2片段。在8月19日的《自然》杂志上,他们的高分辨率分子图谱显示,这部分蛋白质折叠,使其激酶和GTPase结构域接近。这一发现解释了先前的实验数据,这些数据表明这两个领域相互作用。

  • 通过低温成像LRRK2,研究人员解决了它的三维结构。
  • 激酶和GTPase结构域紧密相连。
  • 致病性突变增强了微管结合,从而阻碍了货物运输。

通过结合这两项研究的数据,研究小组确定LRRK2要结合微管,其激酶必须是封闭的或活性的构象。致病性突变,其中一些已知增加微管结合,似乎使分子偏向这种形状。Leschziner和同事的数据暗示微管结合可能导致毒性,因为LRRK2细丝阻碍了汽车蛋白在这些高速公路上的通过,可能导致交通堵塞。

目前正在测试的LRRK2激酶抑制剂作为帕金森病的治疗药物,也可能将该蛋白困在这种封闭的构象中。

微管装饰。LRRK2(黑轮廓)的单体加入,形成围绕微管(灰色)的股线(金色和蓝色)的双螺旋。在微管轴上观察,每个单体具有相对于微管表面(底部)的相同取向。[由Watanabe等人提供。,细胞。]

苏格兰邓迪大学的达里奥·阿莱西(Dario Alessi)在Alzforum上写道:“这两项优雅的研究中描述的新结构代表了我们对LRRK2理解的重要一步。”“这些数据为致病突变如何通过促进LRRK2采用能够结合微管细丝的封闭构象来发挥作用提供了新的见解。”

在本地人栖息地的三维结构中窥视
LRRK2中的突变占家族性PD病例的10%。此外,在许多散发性疾病的情况下,该蛋白质的浓度升高,暗示在病理学中的广泛作用(Di Maio等人,2018)。然而,LRRK2如何为帕金森贡献仍然朦胧。除了作为激酶和GTPAse外,该大蛋白质还包含许多其他蛋白质相互作用域(见下图)。LRRK2参与许多细胞过程,包括囊泡贩运,细胞信号传导和自噬,促使大量假设关于它如何造成伤害(2012年10月的新闻;2013年3月会议新闻)。这种蛋白质的结构图可以帮助研究人员破译其功能,但尽管经过多年的努力,LRRK2一直顽强地抵制结晶。

维拉和他的同事们决定彻底改变LRRK2的测绘挑战。他们推断,与其试图纯化和结晶蛋白质,为什么不简单地把它想象出来呢?他们利用了致病性LRRK2修饰微管这一事实,使其在细胞内易于发现和可视化。联合第一作者Reika Watanabe, Robert Buschauer和Jan Böhning在肾细胞系中表达带有PD突变I2020T的荧光标记LRRK2,冷冻细胞,切薄片,并通过相关光镜和电子显微镜将LRRK2定位在微管上。然后他们将切片以不同的角度倾斜,用电子显微镜对这些修饰过的微管进行成像,这一过程被称为低温电子断层扫描。CryoET从连续的二维表面图像构建三维结构(Lucić等,2008)。通过这种技术,作者将微管结合的LRRK2长丝映射到14埃的分辨率。

臭名昭著的一心多用。除了复合物(ROC)GTP酶(绿色)的RA和激酶结构域(粉红色)之外,LRRK2还包含许多蛋白质蛋白质相互作用域。ROC(COR)N和C结构域的C末端调节GTP酶。这些通常称为cor-a(黄色)和cor-b(橙色)。[由Watanabe等人提供。,细胞。]

维拉说:“据我所知,这是第一次有人在用生物化学方法解决细胞内部结构之前就解决了这个问题。”“我们采用了一种技术上的新奇,但生化上的惰性方法。”

CryoET发现LRRK2分子在每个微管周围形成了一个双螺旋结构,就像拐杖糖的螺旋状条纹(见上图)。在这些LRRK2的长链中,每一个通过各自的WD40结构域与后面的一个结合(是的,这里的WD40是一种胶水,而不是润滑剂),通过各自的corb结构域与前面的一个结合。蛋白质的取向是这样的,它们的c端包含两个催化域,位于微管表面附近,而它们的n端漂浮到细胞质中,不能被低温et分解。这个方向使ROC GTPase结构域面对微管表面,而激酶暴露于细胞质(见下图)。结构模型表明该激酶处于闭合构象,尽管这一细节无法直观地分辨出来。

双二聚。两个LRRK2单体(左)位于微管(轮廓)上,通过它们的COR结构域(黄色)连接,使它们的激酶(粉色)暴露在细胞质中。它们的WD40域(红色)与相邻的单体(灰色)相连。沿微管轴旋转(右)显示紧贴微管表面的GTPase结构域(绿色)。[由Watanabe等人提供。,细胞。]

别墅相信她的小组使用Cryoet在细胞内扫描分子的方法可能有助于裂解其他醋塑的结构,并为蛋白质在其本地环境中提供线索以及疾病期间的变化如何变化。“这是桥接结构和细胞生物学的新时代的开始,”别墅说。

密切接触者。LRRK2的C末端半部分折叠,使其激酶(橙色)和GTP酶(绿色)进入接近。普通帕金森的突变是充分利用的,以改变这种接触(右)。[由Deniston等,自然提供。]

LRRK2的业务结束的高分辨率瞥见
为他们的部分,联合对应的作者Samara Reck-Peterson和同事采取了不同的方法。在法兰克福的歌德大学斯特凡诺拉普的实验室中央塞巴斯蒂安Mathea表达了昆虫细胞中野生型人类LRRK2的C末端一半,发现纯化净化。CO-First Author Colin Deniston通过Cryoem将这些分子成像至3.5埃埃斯特罗姆分辨率。它们确定分子折叠成J形,使ROC GTP酶与激酶结构域密切接触(见上文图像)。以前的研究发现,GTPase活性对于激酶是必不可少的,但目前尚不清楚这些域如何互动(Ito等人,2007;West等人,2007)。在这个蛋白质片段中,激酶呈现出开放的、催化活性不强的形状。

有趣的是,WD40结构域的c端尾部形成了一个沿激酶主干延伸的长α-螺旋,并在多个点与之相互作用。注意到这个α-螺旋包含至少一个磷酸化位点,Leschziner推测这个尾部的修饰可能有助于调节激酶的形状,可能开启或关闭它。

最后,研究人员将他们的模型覆盖到维拉和同事所描述的LRRK2细丝上,看看结构是否匹配。单体拟合较好,但不是很完美,因为COR结构域与相邻的lrrk2相冲突。然而,当Leschziner和他的同事改变他们的结构来模拟一个封闭的激酶结构域时,这些空间冲突消失了(见下图)。Leschziner说,这一发现表明,激酶的开放构象会阻止微管结合。

微管是如何融入的?
LRRK2是否在生理条件下粘附于微管尚不清楚。维拉指出,在含有内源性野生型LRRK2的培养细胞中,该蛋白在微管上不明显。然而,当野生型LRRK2过表达时,它在微管上形成丝。此外,在六种最常见的PD突变中,有五种- i2020t、N1437H、R1441G、R1441C和y1699c促进LRRK2丝的形成。

所有这些突变都会增加激酶的活性,迫使激酶变成封闭的形状。I2020T位于G2019S(最常见的致病性LRRK2突变)之后的激酶结构域激活环内,其他三个位于GTPase和corb结构域之间的接口上,在那里它们被定位来改变激酶和GTPase之间的通信(见上图)。维拉说:“似乎如果你迫使LRRK2进入一种活跃状态,它就会绑定微管。”

开启和关闭。在开放激酶构象中(左图),LRRK2单体与丝状结构的配合很差。当它的激酶(橙色)关闭(右)时,它咔哒一声就到位了。[由Deniston等,自然提供。]

Reck-Peterson的数据表明,微管结合可能会导致问题。共同第一作者John Salogiannis将LRRK2、微管、动力蛋白和动力蛋白结合在细胞游离分析中。马达蛋白通常沿着微管“行走”,将货物分别运送到链的正端和负端。然而,即使是低纳摩尔LRRK2也缩短了马达能够行走的距离。在25nm LRRK2时,电机停止转动,无法跨过螺旋LRRK2链。

没有人知道这个障碍是否有作用,但Leschziner指出,已知LRRK2磷酸化修饰小泡的Rab GTPases亚群,这些小泡通过发动机蛋白沿着微管运输。LRRK2寡聚体与微管的短暂结合可能会使马达暂停足够长的时间,从而使激酶磷酸化Rabs并改变货物的运输方式。

治疗意味着什么?
关于微管结合的问题可能与PD治疗的发展有关。I型激酶抑制剂诱捕酶在其封闭状态,同时通过阻止它结合ATP保持它的活性。I型LRRK2抑制剂增强微管结合吗?Deniston等人的数据表明至少在无细胞检测中也是如此。研究人员将I型抑制剂MLi-2和LRRK2一起添加到他们的实验中,发现抑制剂进一步阻碍了运动蛋白沿着微管的运动。MLi-2是一种药物工具,而不是一种正在开发的药物(Fell等人,2015年;Scott等人,2017)。相反,II型抑制剂,包括BCR-ABL激酶抑制剂GZD-824,其稳定开放激酶构象,释放电动机再次移动。

马里兰州贝斯达国家衰老研究所的Mark Cookson指出,这一发现可能有助于解释LRRK2激酶抑制剂增强细胞内丝状物形成的明显悖论,就像致病性PD突变所做的那样。Cookson写道:“考虑到LRRK2的突变是一种功能获得,我们认为激酶抑制剂具有潜在的治疗作用,这尤其令人困惑。”

Michael J. Fox基金会的Andrew koemeterx - cox在给Alzforum的邮件中写道:“这些数据进一步揭示了LRRK2的另一种潜在病理机制,并可能解释某些LRRK2抑制剂的一些靶向毒性,尽管还需要更多的研究。”同样,阿莱西建议调查II型抑制剂是否会有更少的副作用。

Denali治疗剂有两个LRRK2抑制剂,dnl201DNL151,在第1阶段试验中。他们都被认为是I型。alessi指出,没有人开发LRRK2选择性II型抑制剂。

更多的谜团
科学家正在追求其他LRRK2谜语。Leschziner和Reck-Peterson在其他突变体的结构上设定了他们的景点。好奇地,到目前为止,G2019S尚未显示G2019,以将LRRK2增加与细胞中微管的结合。与其他致病PD突变一样,它会导致激酶。然而,与它们不同,G2019S不会增加细胞中的RAB磷酸化。“G2019S可能与其他机械方式有助于疾病而不是其他机械方式,”Leschziner建议。

为了探究LRRK2的生理作用,Villa将研究内源性LRRK2在pd相关细胞类型(如多巴胺能神经元和胶质细胞)中的作用。在细胞中,这种蛋白质通常与细胞膜有关,而不是微管。当它结合细胞膜的时候会有不同的形状吗?Villa将在细胞培养中招募LRRK2到细胞膜上,并结合低温et和质谱来确定其结构和相互作用伙伴。

NIA的蔡怀滨认为,找到这些相互作用的伙伴是破译蛋白质功能的关键。“未来的研究将需要确定调控不同亚细胞内LRRK2激酶结构域构象变化的信号级联,以及确定任何被LRRK2停止和修改的特定货物,”他在Alzforum上写道(完整评论如下)。-Madolyn鲍曼罗杰斯

评论

  1. 这两篇论文极大地增加了我们对LRRK2的结构知识,迄今为止,这些知识主要基于蛋白质的小片段。在现场识别潜在的结构是特别有用的,用其他技术提高分辨率增加了洞察力。

    我认为最重要的见解是相对开放和封闭的激酶构象可能驱动ROC-COR双结构域的位置。LRRK2与微管相关的研究已经有很长一段时间了(Greggio等人,2006;Kett等人,2012年),但一个奇怪的观察是,一些突变,特别是I2020T和GTPase缺陷的R1441和Y1699突变,倾向于显示丝状染色,而激酶抑制剂也显示相同(Dzamko等人,2010)。考虑到LRRK2的突变是一种功能获得,我们认为激酶抑制剂具有潜在的治疗作用,这尤其令人困惑。激酶抑制剂可以唤起激酶结构域的开放或封闭构象,并通过GTP结合区传播,这一澄清表明,灯丝形成只是LRRK2不同结构域发生的间接测量,与直接测量激酶或GTPase功能不同。

    澄清仍然重要的一个区域是细胞中是否存在额外的LRRK2结构形式,特别是与细胞膜相关的细胞。再次,来自LRRK2生物学早期的文献在细胞骨骼元素上显示了细胞内膜的定位(Alegre-abarrategui等,2009年),在近年来近年来鉴定RAB蛋白作为LRRK2功能的下游效应,这一点有点重新发现。因此,实际问题是在当前纸张中结构上定义的微管吻合率是否代表细胞中LRRK2的次要,但潜在的重要部分,以及其他隔室中的蛋白质是否具有类似的结构。因此,延长这些技术以检查与各种膜结合细胞器相关的LRRK2至关重要。

    参考:

    在一种新的人类基因组报告细胞模型中,LRRK2调节自噬活性并定位于特定的膜微域哼哼莫族。2009年11月1日,18(21):4022 - 34。PubMed

    抑制LRRK2激酶活性会导致丝氨酸(910)/丝氨酸(935)去磷酸化,14-3-3结合的中断和细胞质定位的改变物化学J。2010年9月15日,430(3):405 - 13所示。PubMed

    突变体LRRK2 / Dardarin的毒性作用需要激酶活性一般人说。2006年8月23日(2):329-41。PubMed

    LRRK2帕金森病突变增强其微管关联哼哼莫族。2012年2月15日,21(4):890 - 9。2011年11月11日PubMed

  2. 这两项研究中描述的新结构代表了我们对LRRK2理解的重要进展。这些数据为致病突变如何通过促进LRRK2采用能够结合微管丝的封闭构象来发挥其作用提供了新的见解。作者在生化分析中令人信服地证明,LRRK2与微管结合会阻止基于微管的驱动蛋白马达沿着微丝运动。

    在未来的工作中,建立引起帕金森的内源性LRRK2轴承突变是重要的,导致帕金森的突变也结合微管和干扰微管运动,并解决这是LRRK2与帕金森连接的机制。据我所知,所有广泛使用的LRRK2抑制剂捕获LRRK2在封闭的微管绑定构象中。因此,给予诱导闭合构象的LRRK2抑制剂可以诱导LRRK2与微管结合并导致不希望的效果。因此,开发一种新的LRRK2抑制剂,将捕获LRRK2在开放的非微管结合构象中的新类LRRK2抑制剂。这应该是可能的,并且已经为其他蛋白激酶开发了称为“II型”的激酶抑制剂。将对处理细胞与两类的LRRK2抑制剂的影响进行比较,如果捕获在开放的非微管结合构象中的II型抑制剂的施用剂的施用,则对其进行对处理细胞的影响并进行测试。

  3. LRRK2与微管的相互作用是在不断努力的最早观察中,了解该大帕金森病(PD) - 相关的多域蛋白的生物学功能。在我的思想中,记忆仍然生动我们的斗争来解释,在2009年发表的一篇文章中,为什么PD相关的G2019S突变体LRRK2蛋白质促进并稳定微管组件,而不是常见的致病机理涉及许多其他与疾病相关的突变。十多年之后,这两个优雅的文章通过细胞和自然发表的背靠背发表了新的结构细节和通过Cryo-EM和SofoMogram分析为LRRK2和微管共同组装提供了新的结构细节和功能洞察。

    Watanabe及其细胞论文的同事证明LRRK2蛋白质在培养细胞中围绕微管束寡聚化。Deniston等人。在自然界中,进一步提供LRRK2和微管吻合的原子模型。它们特别突出显示了LRRK2激酶结构域的构象变化,即Open /无活性与闭合/活性,用于调节LRRK2对微管的寡聚化。闭合构象有利于LRRK2聚合物周围微管的关联,而打开构象则致密。此外,他们发现I型LRRK2激酶抑制剂促进闭合构象,但II型抑制剂稳定开放结构,表明不同类型的LRRK2激酶抑制剂可能产生面对面的结果。为了支持LRRK2-微管相互作用的功能意义,Deniston等人。证明LRRK2聚合物周围的MicroTumules附着阻断Kinesin和Dynin Motor蛋白介导的货物运输。但是,LRRK2可能不仅仅是道路阻挡者。例如,通过LRRK2的微管包裹可以阻碍微管网的动态拆卸,并干扰微管侧链的改性。

    未来的研究需要确定调控不同亚细胞腔室LRRK2激酶结构域构象变化的信号级联,以及确定任何被LRRK2停止和修饰的特定物质。

  4. LRRK2的RCKW结构域的高分辨率结构是我们对该蛋白及其结构域如何相互作用调节功能的理解的一个巨大飞跃。这一数据进一步揭示了LRRK2的另一种潜在病理机制,并可能解释某些LRRK2抑制剂的一些靶向毒性。不过,还需要更多的研究。

    这一突破给我们带来了希望,我们可以实现一个更高分辨率的LRRK2结构,以帮助设计改进的LRRK2抑制剂。它也验证了Michael J. Fox基金会解决整个领域挑战的方法。我们资助了这些研究人员——正如我们有其他大型合作项目一样——以消除帕金森病的生物学理解和治疗发展的障碍。

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参考文献

Alzpedia Citations.

  1. 富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)

新闻引用

  1. LRRK2的许多面孔
  2. LRRK观察者的眼睛转向炎症,自噬,激酶

疗法的引用

  1. dnl201
  2. DNL151

论文被引用次数

  1. LRRK2在特发性帕金森病中的激活SCI翻译Med.。2018年7月25日,10 (451)PubMed
  2. 细胞低温电子断层扫描:连接结构和功能Histochem细胞生物。2008年8月,130(2):185 - 96。2008年6月20日PubMed
  3. GTP结合是LRRK2蛋白激酶活性的关键,LRRK2是家族性帕金森病的致病基因产物生物化学。2007年2月6; 46(5):1380-8。PubMed
  4. 帕金森病相关的LRRK2突变增强了gtp结合和激酶活性与神经元毒性的关系哼哼莫族。2007年1月15日,16(2):223 - 32。PubMed
  5. MLi-2是一种有效的、选择性的、中心活性化合物,用于探索LRRK2激酶抑制的治疗潜力和安全性J药物实验。2015年12月,355(3):397 - 409。Epub 2015年9月25日PubMed
  6. 发现一种3-(4-嘧啶基)茚唑(MLi-2),一种口服可获得和选择性富亮氨酸重复激酶2 (LRRK2)抑制剂,可降低脑激酶活性J Med Chem.。2017年4月13日;60(7):2983 - 2992。2017年3月16日PubMed

进一步阅读

主要论文

  1. 帕金森病相关LRRK2的原位结构细胞。2020年8月7日;PubMed
  2. 帕金森病中LRRK2的结构和微管相互作用模型自然。2020年8月19日;PubMed